摘要 為了研究多壁碳納米管(MWCNTs)聯(lián)合納秒脈沖電場(nsPEF)影響離體細(xì)胞活性的劑量效應(yīng)，采用 CCK-8 檢測法對比分析皮膚癌 A375 細(xì)胞活性隨場強(qiáng) E、脈寬 τ、脈沖個數(shù) N 等單因素的變化規(guī)律。研究表明，細(xì)胞活性隨場強(qiáng)和脈寬的變化具有閾值效應(yīng)(S 型變化)，而隨脈沖個數(shù)的變化無明顯的閾值效應(yīng)(指數(shù)型變化)。細(xì)胞活性隨脈沖注入能量 E(τN) 0.5 的增加呈現(xiàn) S 型下降。基于 logistic 模型利用一元非線性回歸分析方法分別擬合得到細(xì)胞活性與三個脈沖參數(shù)間的函數(shù)關(guān)系。同時，建立細(xì)胞活性與多因素之間的歸一化關(guān)系。結(jié)果表明，MWCNTs 的加入不影響細(xì)胞活性與脈沖參數(shù)間的變化規(guī)律，但是明顯降低了 nsPEF 殺傷腫瘤細(xì)胞所需要的幅值，從而可以有效提高 nsPEF 在腫瘤治療中的電氣安全性。

　　關(guān)鍵詞：多壁碳納米管 納秒脈沖電場 細(xì)胞活性 logistic 模型 歸一化關(guān)系

　　0 引言

　　納秒脈沖電場(nanosecond pulsed electric field， nsPEF)不需要毒性化療藥物的參與就能通過誘導(dǎo)凋亡而使腫瘤組織縮小甚至消失，避免了炎癥、潰瘍與藥物的副作用[1,2]，對于腫瘤治療具有特別重要的意義。然而，nsPEF 必須采用高場強(qiáng)，在實驗過程中需要借助電極將幅值非常高的脈沖電場引入到腫瘤組織，而過高的場強(qiáng)容易引起靶向組織的沿面放電[3,4]，這也會對治療過程的順利進(jìn)行、治療設(shè)備的可靠性產(chǎn)生影響。近年來，碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)優(yōu)異的電學(xué)特性在生物電效應(yīng)中的應(yīng)用潛力逐漸引起人們的關(guān)注。CNTs 是一種具有特殊結(jié)構(gòu)(徑向尺寸為納米級，軸向尺寸為微米級)的一維量子材料，并且由于碳納米管的結(jié)構(gòu)與石墨的片層結(jié)構(gòu)相同，所以具有高電導(dǎo)率[5]。具備大長徑比以及優(yōu)良電導(dǎo)率的 CNTs 可以增強(qiáng)局部場強(qiáng)[6]，國外一些學(xué)者已經(jīng)將 CNTs 的這一特性應(yīng)用到脈沖電場治療腫瘤的領(lǐng)域中。根據(jù)卷曲層數(shù)的差異，CNTs 可以分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes， SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)[7]。由于 MWCNTs 的毒性低于 SWCNTs[8]，所以 MWCNTs 在生物電磁中的應(yīng)用更為廣泛。 Stacey 等將 MWCNTs 引入到 nsPEF(50 kV/cm， 300 ns，8 個脈沖)殺傷胰腺癌細(xì)胞系 PANC1 的實驗 中 ， 利 用 臺 盼 藍(lán) 檢 測 細(xì) 胞 存 活 率 [9]。 與 不 加 MWCNTs 的實驗相比，MWCNTs 的引入可以使細(xì)胞存活率降低 2.3 倍，證明 MWCNTs 獨特的電子特性與脈沖電場在殺傷腫瘤細(xì)胞中的協(xié)同作用。Raffa 等在脈沖電場(45-55 V/cm，40 ms，1 Hz，500 個脈沖)處理 HN9 及 CRFK 細(xì)胞的過程中將 MWCNTs (5-10 μg/ml)加入到細(xì)胞懸浮液，以此促進(jìn)細(xì)胞的透化率，從而增強(qiáng)細(xì)胞對藥物大分子的攝取，利用臺盼藍(lán)染料代替藥物大分子檢測細(xì)胞的通透性[10]。實驗證明 MWCNTs 的引入可以將細(xì)胞通透性由 4% 提高到 80%，并在該實驗的基礎(chǔ)上提出 MWCNTs 在脈沖電場作用下的介電響應(yīng)可能是導(dǎo)致電穿孔增強(qiáng)的原因。Wang 等在 MWCNTs 的存在下將脈沖電場(50 V/cm，40 ms，5 Hz，500 個脈沖)作用于乳腺癌細(xì)胞[11]。利用臺盼藍(lán)檢測到細(xì)胞膜即時透化率增加至 38.62%，是不含 MWCNTs 實驗的 2.77 倍。此外，還觀察到細(xì)胞發(fā)生了不可逆電穿孔，在脈沖處理后 24 小時僅有 39.23%的細(xì)胞存活，而不存在 MWCNTs 的細(xì)胞存活率為 87.01%。Liu 等利用有限元法基于介電電泳理論仿真研究了單根 MWCNTs 與細(xì)胞膜在脈沖電場處理下的作用過程[12]。結(jié)果表明，MWCNTs 尖端在電場中引起的介電泳力能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞膜快速的機(jī)械變形，從而增強(qiáng)細(xì)胞電穿孔效應(yīng)。以上研究都從不同角度證明了 MWCNTs 增強(qiáng)脈沖電場殺傷腫瘤細(xì)胞效果的可行性。但是，迄今為止，MWCNTs 增強(qiáng)脈沖電場殺傷癌細(xì)胞效果的相關(guān)研究也只是在單一脈沖因素、特定參數(shù)范圍的基礎(chǔ)上驗證 MWCNTs 的引入具有增強(qiáng)脈沖電場生物電效應(yīng)的作用，沒有更加系統(tǒng)、全面地建立 MWCNTs 聯(lián)合 nsPEF 殺傷腫瘤細(xì)胞的劑量效應(yīng)。為了對后續(xù)開展機(jī)理研究選擇脈沖參數(shù)提供必要的參考依據(jù)，首先必須從宏觀角度研究引入 MWCNTs 后不同脈沖參數(shù)下的 nsPEF 對離體細(xì)胞的殺傷效果。對此，本文將在探究 MWCNTs 毒性的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究有無 MWCNTs 時細(xì)胞活性隨場強(qiáng)、脈寬、脈沖個數(shù)等單因素的定性變化規(guī)律和定量函數(shù)關(guān)系，并建立細(xì)胞活性與多因素的歸一化關(guān)系,以期為后續(xù)在腫瘤組織中的進(jìn)一步研究提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人皮膚癌

　　A375 細(xì)胞系(由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究院捐贈)置于高糖 DMEM 培養(yǎng)基(血清和抗生素的占比分別為 10%和 1%)中，于 CO2 體積分?jǐn)?shù)為 5%、溫度為 37℃、飽和濕度的環(huán)境中生長，1-2 天傳代一次。

　　1.2 MWCNTs 毒性的確定

　　MWCNTs 分散液(W/V=20 000 μg/ml)購置于中科院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，所用 MWCNTs 的外徑和長度分別為 8-15 nm 和 50 μm 左右，其在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope， TEM)下的微觀結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。取不同體積 MWCNTs 分 散 液 于 新 鮮 培 養(yǎng) 基 中 ， 分 別 調(diào) 整 MWCNTs 的最終濃度為 0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml。將處于對數(shù)生長期的 A375 細(xì)胞用 0.25%的胰酶消化后離心 5 分鐘(800 轉(zhuǎn)/分鐘)，棄去上清液，用上述含有不同濃度 MWCNTs 的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106 cells/ml。將上述細(xì)胞懸液于室溫下靜置 1 小時后用 PBS 離心清洗兩遍，并用不含 MWCNTs 的新鮮培養(yǎng)基重懸(細(xì)胞濃度為 1×105 cells/ml)，取 200 μl 溶液于 96 孔板中，在 CO2 體積分?jǐn)?shù)為 5%、溫度為 37℃、飽和濕度的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng) 8 小時。利用 CCK-8 試劑盒檢測各個實驗組的細(xì)胞活性，對照組為 MWCNTs 濃度為 0 μg/ml 的細(xì)胞懸液。

　　1.3 細(xì)胞活性的檢測使用

　　CCK-8 細(xì)胞增殖實驗評估細(xì)胞活力，當(dāng)含有細(xì)胞的 96 孔板在孵箱中培育 8 小時后，利用移液器緩慢吸掉 96 孔板上清液，用 PBS 清洗兩遍并重新加入 110 μl 培養(yǎng)基與 CCK-8 的混合溶液(培養(yǎng)基與 CCK-8 的比例為 10:1)，繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng) 1.5 小時。在該測定中，CCK-8 可以被細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物 Formazan。利用酶標(biāo)儀(EPOCH2，Biotek)測量每組實驗的吸光度，波長設(shè)定為 450 nm。細(xì)胞活性=(實驗組吸光值-空白組吸光值)/ (對照組吸光值-空白組吸光值)×100%，其中空白組為不含細(xì)胞的混合培養(yǎng)液。

　　1.4 nsPEF 系統(tǒng)

　　實驗平臺如圖 2 所示，相關(guān)裝置包括：實驗室自制的納秒脈沖發(fā)生器[13]、現(xiàn)場可編程邏輯門陣列( Field-Programmable Gate Array ， FPGA) 模 塊(AX301，Alinx)、個人電腦(PC)、示波器(WavePro 7 Zi–A，Teledyne Lecroy)、高壓探頭(PPE5KV， Teledyne Lecroy)、 皮 爾 森 線 圈 ( 2877， Pearson Electronics)、電擊杯(BTX，容積 450 μl，間距 2 mm)。在 PC 端對 FPGA 模塊編程，通過控制 FPGA 產(chǎn)生特定脈寬及頻率的信號以控制納秒脈沖發(fā)生器的輸出，發(fā)生器的輸出直接連接到裝有細(xì)胞懸浮液的電擊杯兩端，同時利用示波器對細(xì)胞懸液兩端的電壓以及流經(jīng)懸液的電流信號進(jìn)行采集。幅值為 1 kV，脈寬為 300 ns 時，脈沖電壓和電流波形如圖 3 所示。

　　1.5 nsPEF 處理細(xì)胞的實驗方案

　　表 1 為實驗所采用的脈沖參數(shù)水平值，固定脈沖頻率為 1 Hz，MWCNTs 濃度為安全劑量下的最大值，其余參數(shù)(場強(qiáng) E、脈寬 τ、脈沖個數(shù) N)均為 5 水平。當(dāng)探究細(xì)胞活性隨某一脈沖參數(shù)的影響規(guī)律時，其余參數(shù)均設(shè)定為中間值，例如研究場強(qiáng)對細(xì)胞活性的影響規(guī)律，脈寬和脈沖個數(shù)分別設(shè)定為 300 ns 和 100。對于每一組實驗方案，分別在加 MWCNTs 以及不加 MWCNTs 的情況下實施。為了使大部分細(xì)胞在 nsPEF 處理期間承受更均勻的電場，將貼壁生長型細(xì)胞酶解為細(xì)胞懸液，然后取 70 μl 細(xì)胞懸液于電擊杯中，此時大部分細(xì)胞將處于場強(qiáng)更加均勻的電擊杯中間區(qū)域，并對其進(jìn)行相應(yīng)的 nsPEF 處理。對照組設(shè)置為將同等體積不加 MWCNTs 的細(xì)胞懸液加入電擊杯但是不對其進(jìn)行 nsPEF 處理。脈沖處理后，利用 CCK-8 試劑盒測量各個實驗組的細(xì)胞活性，相關(guān)操作與 MWCNTs 毒性實驗相同。

　　1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

　　采用 OriginPro 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用 x(均值)±s(標(biāo)準(zhǔn)差)表示，利用單因素方差分析評估實驗數(shù)據(jù)的顯著性差異。P<0.05 為實驗數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

　　2 結(jié)果

　　2.1 MWCNTs 毒性

　　為了將 MWCNTs 引入到 nsPEF 殺傷細(xì)胞的研究中，必須保證其對細(xì)胞具有低毒性，即高的生物相容性。A375 細(xì)胞生長于含有不同濃度 MWCNTs 的環(huán)境中，通過測量 MWCNTs 對細(xì)胞活性的影響確定合理的 MWCNTs 濃度。圖 4 顯示，當(dāng) MWCNTs 濃度為 300 μg/ml 時，細(xì)胞活性降低到 92%，并且隨著 MWCNTs 濃度的升高，細(xì)胞活性越低，與對照 組 相 比 ， 組 間 及 組 內(nèi) 數(shù) 據(jù) 都 具 有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異(P<0.05)。相反，當(dāng) MWCNTs 濃度小于或等于 200 μg/ml 時，細(xì)胞活性幾乎沒有變化，表明在此濃度范圍內(nèi)，MWCNTs 對細(xì)胞活性無影響，與對照組相比，組間及組內(nèi)數(shù)據(jù)都不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。即后續(xù) nsPEF 處理 A375 細(xì)胞所用 MWCNTs 濃度小于或等于 200 μg/ml 即可。

　　2.2 細(xì)胞活性隨不同脈沖參數(shù)的變化規(guī)律

　　設(shè)定 nsPEF 處理 A375 細(xì)胞時的 MWCNTs 濃度為無毒性時的最大值，即 200 μg/ml，在此基礎(chǔ)上通過改變場強(qiáng)、脈寬、脈沖個數(shù)，研究 MWCNTs 聯(lián)合 nsPEF 處理腫瘤細(xì)胞的劑量效應(yīng)，并建立細(xì)胞活性與單因素間的擬合公式。圖 5 顯示了場強(qiáng)、脈寬、脈沖個數(shù)等單因素對細(xì)胞活性的影響結(jié)果。實驗結(jié)果以柱狀圖和折線圖疊加在一起的方式展示，紅色折線(實線)和藍(lán)色折線(虛線)分別表示不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的實驗結(jié)果變化趨勢。圖例中“–MWCNTs”和“+MWCNTs”分別指“不加 MWCNTs”以及“加 MWCNTs”。與不加 MWCNTs 的結(jié)果相比，加入 MWCNTs 可以明顯降低細(xì)胞活性，但并沒有影響細(xì)胞活性隨單因素變化的下降規(guī)律。圖 5(a)表明，當(dāng)固定脈寬 300 ns、脈沖個數(shù) 100 個時，細(xì)胞活性隨場強(qiáng)呈現(xiàn) S 型衰減;圖 5(b)表明，當(dāng)固定場強(qiáng) 6 kV/cm、脈沖個數(shù) 100 個時，細(xì)胞活性隨脈寬呈現(xiàn) S 型衰減;圖 5(c)表明，當(dāng)固定場強(qiáng) 6 kV/cm、脈寬 300 ns 時，細(xì)胞活性隨脈沖個數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)型衰減。

　　為了更清晰地表明并且預(yù)測細(xì)胞活性隨各個脈沖參數(shù)的變化趨勢，采用 logistic 回歸模型擬合實驗數(shù)據(jù)以得到細(xì)胞活性的輸入輸出公式。 Logistic 回歸模型幾乎已經(jīng)成為流行病學(xué)和醫(yī)學(xué)中最常用的分析方法之一，尤其適合根據(jù)危險因素預(yù)測某疾病發(fā)生的概率。Cole 在研究微生物熱失活時針對細(xì)菌存活率隨熱處理時間呈 S 型曲線下降的趨勢提出了對應(yīng)的 logistic 模型[14]，此模型也適用于指數(shù)衰減型曲線的擬合，相關(guān)公式為：  0 10 1 exp(4 ( log ( ))/( )) 10 t t S t             (1)其中，t 為自變量，S´為觀察到的生物學(xué)效應(yīng)，參數(shù) α 和分別代表曲線上漸近線(t=0)和下漸近線(t→∞)對應(yīng)的細(xì)菌存活率的對數(shù)，δ 和 t0 分別表示曲線的最大斜率以及最大斜率所對應(yīng)的橫坐標(biāo)位置。根據(jù)圖 5 所示結(jié)果，細(xì)胞活性在脈沖參數(shù)為低劑量時幾乎沒有變化，接近于 100，即曲線上漸近線為 100，所以 α 的值可以由下式計算得出： 10    log (100) 2 (2)修正后的 logistic 模型公式為：  0 10 2 2 1 exp(4 ( log ( ))/( 2)) 10 t t S t           (3)公式(3)中的參數(shù)含義與公式(1)一致。利用 Matlab 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行一元非線性擬合可以得到公式(3)中三個未知參數(shù)的最優(yōu)值以及擬合準(zhǔn)確度 R 2，從而可以確定曲線的函數(shù)關(guān)系式，對應(yīng)的擬合曲線和 R 2 見圖 6。紅色曲線(實線)和藍(lán)色曲線(虛線)分別代表用 logistic 模型對不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的實驗結(jié)果擬合得到的曲線。R 2 被用來評價模型的擬合準(zhǔn)確度，其介于 0 到 1 之間，越接近于 1，說明所選模型與實驗結(jié)果的匹配度越高。

　　由各曲線的 R 2 可知，采用 logistic 模型可以較為準(zhǔn)確地描述實驗規(guī)律。圖 6 表明，細(xì)胞活性隨場強(qiáng)、脈寬變化時具有閾值效應(yīng)，即在低脈沖劑量下，細(xì)胞活性幾乎不變，當(dāng)脈沖劑量高于某個閾值后，細(xì)胞活性開始急劇下降，并且在下降到一定程度后開始飽和。相比之下，細(xì)胞活性隨脈沖個數(shù)的增加沒有明顯的閾值變化點，但是也會隨著脈沖個數(shù)的增加出現(xiàn)飽和趨勢。

　　2.3 細(xì)胞活性與多因素間的歸一化關(guān)系

　　為了進(jìn)一步分析有無 MWCNTs 時場強(qiáng)、脈寬、脈沖個數(shù)三個參數(shù)與細(xì)胞活性的綜合關(guān)系，假設(shè)細(xì)胞活性 S´與注入的脈沖能量密度 σE2 τN 有關(guān)，σ 為細(xì)胞懸液的電導(dǎo)率，當(dāng) σ 為一定值時：    0.5 S F E N  (4)式中，F(xiàn) 為 E(τN) 0.5 的函數(shù)。以脈沖注入能量 E(τN) 0.5 為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活性為縱坐標(biāo)，繪出如圖 7 所示的散點圖，脈沖注入能量為 0 時即為對照組。圖 7 中紅色曲線(實線)與藍(lán)色曲線(虛線)代表的含義與圖 6 類似。圖 7 表明，不論有無 MWCNTs，細(xì)胞活性與脈沖注入能量 E(τN) 0.5之間整體呈現(xiàn) S 型的變化規(guī)律。即當(dāng)脈沖注入能量很小且未達(dá)到所需的能量閾值時，基本不影響細(xì)胞活性;當(dāng)脈沖注入能量超過閾值點時，細(xì)胞活性開始出現(xiàn)急劇下降，最后穩(wěn)定在某一飽和值，此時細(xì)胞活性隨脈沖注入能量的增大幾乎沒有變化。

　　基于 logistic 模型，得到細(xì)胞活性 S´與脈沖注入能量 E(τN) 0.5 的擬合曲線，如圖 7 所示。表 2 為對應(yīng)擬合曲線的參數(shù)最優(yōu)值及擬合度。 由 logistic 模型中參數(shù) ω 的物理含義可得，細(xì)胞活性在不加 MWCNTs 和加 MWCNTs 時所達(dá)到的飽和值分別為 10 0.559 9=3.63 和 10 0.538 6=3.46，兩者之間并無明顯區(qū)別，均近似為 3.5。細(xì)胞活性閾值約為 90(曲線下降階段距離上漸近線 10%的位置)，飽和值約為 12(曲線下降階段距離下漸近線 10%的位置)[15]。細(xì)胞活性在不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的情況下達(dá)到閾值所需要的注入劑量分別為 654 和 540，達(dá)到飽和值所需要的注入劑量分別為 1 190 和 912。即 MWCNTs 的引入可以同時減小殺傷細(xì)胞所需的起始能量閾值和飽和能量值。

　　3 討論

　　3.1 不同濃度 MWCNTs 對細(xì)胞活性的影響

　　不同濃度MWCNTs的毒性實驗表明，MWCNTs 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有劑量依賴性，即MWCNTs濃度越高，毒性越強(qiáng)。需要注意的是，除了MWCNTs，在碳納米管的制備過程中，還殘留有少量的催化劑和非離子表面活性劑[9,16]。其中，非離子表面活性劑主要用于解決碳納米管的團(tuán)聚問題。研究表明， MWCNTs的毒性主要由殘留催化劑以及分散劑造成，并且殘留物的濃度越高，對細(xì)胞活性的影響越明顯[17,18]，這與本實驗的結(jié)果相符。

　　3.2 細(xì)胞活性隨不同脈沖參數(shù)的變化規(guī)律

　　細(xì)胞在正常的生理機(jī)能狀況下，由于其膜的選擇通透性會阻止大分子物質(zhì)的通過，從而維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡。但是當(dāng)細(xì)胞暴露于電場中，電荷會向細(xì)胞膜兩側(cè)積累，形成跨膜電位。當(dāng)跨膜電位超過細(xì)胞膜的絕緣強(qiáng)度時，細(xì)胞膜上會產(chǎn)生微孔 [19]，打破細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡，從而影響細(xì)胞的正常生長狀態(tài)。對于單個球形細(xì)胞，不可逆電穿孔所需要的外加場強(qiáng)閾值Et可以表示為[20]：

　　E d (5)其中，Δφ 為細(xì)胞膜閾值跨膜電位，d 是球形細(xì)胞的直徑，θ 是細(xì)胞膜上特定位置的法線方向與外加電場 E 方向的夾角。除了外加電壓要達(dá)到閾值，電穿孔現(xiàn)象是否可以發(fā)生還取決于脈沖持續(xù)時間[21]。如果施加的脈沖電壓持續(xù)時間太短，在脈沖電場撤去后細(xì)胞膜兩側(cè)的電荷分布會重新恢復(fù)到初始狀態(tài)，無法產(chǎn)生電穿孔效應(yīng)。球形細(xì)胞達(dá)到閾值跨膜電位所需要的最短脈沖持續(xù)時間 τ´(時間常數(shù))為[22]： 2 1 ( ) 2 Cd     (6) ρ1 和 ρ2 分別為細(xì)胞外液和細(xì)胞質(zhì)的電阻率，C 為細(xì)胞膜的等效電容。綜上所述，根據(jù)電穿孔原理可知，電穿孔效應(yīng)的產(chǎn)生不僅要求外加電壓超過一定閾值，還要求脈寬達(dá)到細(xì)胞膜的充電時間常數(shù)。這也解釋了圖 6 中為 什 么 當(dāng) 場 強(qiáng) 或 者 脈 寬 過 低 時 ， 不 論 有 無 MWCNTs，nsPEF 幾乎對細(xì)胞活性無影響，從而細(xì)胞活性隨場強(qiáng)和脈寬的增加均呈現(xiàn) S 型變化。細(xì)胞活性隨脈沖個數(shù)的變化幾乎沒有閾值效應(yīng)，而是呈現(xiàn)指數(shù)型變化，主要是因為當(dāng)改變脈沖個數(shù)時，場強(qiáng)和脈寬的固定值達(dá)到了電穿孔所需要的閾值。脈沖個數(shù)越多，脈沖電場造成的細(xì)胞穿孔狀態(tài)維持時間越久，細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換越充分，也越容易破壞細(xì)胞的生存環(huán)境，從而造成細(xì)胞死亡。

　　3.3 MWCNTs 增強(qiáng) nsPEF 殺傷細(xì)胞效果的機(jī)制

　　CNTs是一種具有特殊結(jié)構(gòu)(徑向尺寸為納米級，軸向尺寸為微米級，管子兩端基本上都封口)的一維量子材料，主要由呈六邊形排列的碳原子構(gòu)成數(shù)層到數(shù)十層的同軸圓管。CNTs具有獨特的電學(xué)特性，呈現(xiàn)良好的金屬性(電導(dǎo)率約為104 S·cm-1)，研究表明，其載流能力是銅線的1 000倍[23]，使其可以在癌細(xì)胞附近形成三維導(dǎo)電基質(zhì)。將具有一維結(jié)構(gòu)的單根CNTs插入到幅值為E0的均勻電場區(qū)域中，會在CNTs的尖端產(chǎn)生場強(qiáng)增強(qiáng)效果。CNTs尖端的電場增強(qiáng)效果可以通過以下公式估算[24]： tip 0 E L E D  (7) Etip 為 CNTs 尖端的電場強(qiáng)度，β 是一個常數(shù)， L 和 D 分別表示 CNTs 的長度和外徑，CNTs 的高縱橫比(L/D)解釋了為什么其可以很好地集聚場強(qiáng)，從而促進(jìn)電穿孔的效果。除此之外，研究表明處于電磁場中的 CNTs 還可以通過與細(xì)胞膜直接物理接觸對其產(chǎn)生機(jī)械破壞作用[11,25]。CNTs 在未施加電場之前將會因為其大比表面積和強(qiáng)烈的表面靜電作用隨機(jī)吸附到細(xì)胞膜周圍，并且部分 CNTs 還會與細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，此時 CNTs 的存在對細(xì)胞形態(tài)無影響。但當(dāng)施加電場后， CNTs 會因為在電磁場中受到極化作用而旋轉(zhuǎn)，直至與外加電場方向相同，在 CNTs 的旋轉(zhuǎn)過程中，其尖端受到的介電泳力將因為機(jī)械作用引起細(xì)胞膜變形和穿孔。總之，CNTs 的局部電場增強(qiáng)能力和物理破壞能力可以有效提高 nsPEF 殺傷癌細(xì)胞的效果。

　　4 結(jié)論

　　本文，我們在確定 MWCNTs 安全濃度的基礎(chǔ)上探究了 MWCNTs 聯(lián)合 nsPEF 影響離體 A375 細(xì)胞活性的劑量效應(yīng)。細(xì)胞活性隨各個脈沖參數(shù)的變化整體呈現(xiàn)劑量越大，活性越低的規(guī)律。細(xì)胞活性隨場強(qiáng)、脈寬的變化具有閾值效應(yīng)，但是隨脈沖個數(shù)的變化卻沒有明顯的閾值效應(yīng)，并且隨各個脈沖參數(shù)的變化都呈現(xiàn)飽和效應(yīng)。細(xì)胞活性與脈沖能量密度的歸一化關(guān)系呈 S 型規(guī)律。具有良好電學(xué)特性和一維結(jié)構(gòu)的 MWCNTs 不影響上述變化規(guī)律，但是可以顯著增強(qiáng) nsPEF 對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，對提高臨床治療過程中的電氣安全性具有重要意義。

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