戊己丸是臨床上治療腸易激綜合癥、胃潰瘍等消化道疾病的常用方劑，是收錄于2010年版藥典中的經(jīng)典名方，其在《幼幼新書(shū)》、《太平惠民合劑局方》、《醫(yī)方考》等歷代醫(yī)書(shū)中均有記載。戊己丸由黃連，吳茱萸和土炒白芍3味藥組成，然歷代醫(yī)書(shū)中記載的戊己丸配伍比例卻不盡相同，2010年版藥典收錄戊己丸由黃連-吳茱萸-土炒白芍6∶1∶6組成[1]。

　　[摘要]采用L9（34）正交設(shè)計(jì)將戊己丸中黃連，吳茱萸，白芍提取物組成9組配伍方，以及相應(yīng)劑量的單味藥方，共計(jì)18個(gè)方。建立并采用UPLC-MS/MS方法測(cè)定并比較不同配伍方代表成分小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、芍藥苷在大鼠口服給藥2h后在肝臟中的濃度比較戊己丸不同配伍方中有效成分在大鼠肝臟中的濃度。結(jié)果顯示戊己丸配伍方中有效成分在肝中的濃度與相同劑量的單味藥組方存在明顯差異，相同劑量配伍方之間也存在差異。黃連與低、高劑量吳茱萸中吳茱萸堿濃度成正相關(guān)，吳茱萸與低劑量黃連中小檗堿的濃度成負(fù)相關(guān)，與中劑量黃連中小檗堿的濃度成正相關(guān)，與中劑量白芍中芍藥苷濃度成正相關(guān)。白芍與中劑量黃連中巴馬汀濃度成負(fù)相關(guān)、與中劑量吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿濃度成負(fù)相關(guān)。提示了黃連、吳茱萸、白芍之間相互作用導(dǎo)致了各活性成分在肝中分布的差異，分析顯示各代表成分2h在肝中濃度最大的配伍比為12∶6∶6。

　　[關(guān)鍵詞]藥劑師職稱(chēng)論文,戊己丸,配伍,肝臟分布

　　有研究表明，戊己丸配伍不同，其藥效也不盡相同。王婭杰等[2]通過(guò)比較戊己丸提取物黃連-吳茱萸-白芍12∶2∶3與12∶1∶12的優(yōu)選方對(duì)豚鼠離體結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)二者均可抑制乙酰膽堿誘導(dǎo)的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)，卻呈現(xiàn)出不同的作用特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。宮海民等[3]比較了2種不同配伍比例的戊己丸的藥效，發(fā)現(xiàn)黃連-吳茱萸-白芍1∶1∶1時(shí)長(zhǎng)于鎮(zhèn)痛，5∶1∶1時(shí)長(zhǎng)于抗炎。為此，本課題組采用藥代動(dòng)力學(xué)的技術(shù)和手段，通過(guò)研究和比較戊己丸不同配伍組方有效成份在體內(nèi)的吸收和處置情況，探究各單味藥之間的相互作用和配伍規(guī)律，進(jìn)而闡釋戊己丸的配伍原理及機(jī)制。

　　肝是機(jī)體的最重要的代謝器官。課題組前期通過(guò)血藥濃度-時(shí)間曲線[4]以及體外肝微粒CYP450酶代謝模型[5-6]、肝灌流模型[7]研究發(fā)現(xiàn)，戊己丸配伍不同，體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、對(duì)肝中CYP450酶的影響以及肝臟對(duì)各代表成份的攝取均存在明顯的差異。然而，藥物通常要分布到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞里才能跟細(xì)胞內(nèi)的代謝酶發(fā)生相互作用（生物轉(zhuǎn)化或影響代謝酶活性）抑或通過(guò)膽汁排泄[8]。因此，了解藥物在肝臟中的分布有著重要意義。

　　本實(shí)驗(yàn)在之前研究的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)，將戊己丸三味藥的提取物組成不同配伍方，以期通過(guò)研究各配伍方的在肝中的分布特征，更為深入的了解藥物在肝臟乃至體內(nèi)的處置過(guò)程，同時(shí)冀求從分布的角度探索戊己丸配伍的規(guī)律及意義，為更深入的研究戊己丸的配伍機(jī)制提供基礎(chǔ)。

　　1材料

　　1.1動(dòng)物

　　雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級(jí)，體重（220±20）g，中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供，合格證號(hào)SCXK（京）2009-0017。在恒溫，光照周期12h∶12h環(huán)境中飼養(yǎng)3d后實(shí)驗(yàn)。

　　1.2儀器

　　超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（WatersXevoTQMS-AcquityUPLCSystem，MasslynxV4.1工作站）；MSU225S-000-DU型1/10萬(wàn)電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；PotterS型勻漿機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）；VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；NA-5L型氮空一體機(jī)（北京中興匯利科技發(fā)展有限公司）；Centrifuge5424R型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；Milli-QAdvantageA10超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

　　1.3試劑與試藥

　　鹽酸小檗堿（Ber，批號(hào)110713-201212），鹽酸巴馬汀（Pal，批號(hào)110732-201108），吳茱萸堿（Evo，批號(hào)110802-200606），吳茱萸次堿（Rut，批號(hào)110801-201006），芍藥苷（Pae，批號(hào)110736-201136），鹽酸苯海拉明（Dip，批號(hào)100066-200807），梔子苷（Gar，批號(hào)110749-200714），對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈，甲醇，甲酸均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）。高純水（自制）。

　　黃連提取物、吳茱萸提取物、白芍提取物由中日友好醫(yī)院藥劑室提取，得率分別為19.3%，17.7%，9.37%，均為真空干燥固體粉末。其中各提取物中代表成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：黃連提取物中Ber23.03%，Pal5.52%；吳茱萸提取物中Evo0.38%，Rut0.48%；白芍提取物中Pae13.41%。本實(shí)驗(yàn)配伍方為各單味藥提取物的混合，且全部實(shí)驗(yàn)均采用同一批次的提取物。

　　2方法

　　2.1戊己丸配伍方設(shè)計(jì)

　　采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，將戊己丸中黃連、吳茱萸、白芍3味藥作為不同因素，根據(jù)2010年版藥典臨床劑量及配比和歷代醫(yī)方記載之配比，設(shè)計(jì)各單味藥的高中低劑量，作為3個(gè)水平，得到9個(gè)配伍方（1#～9#），同時(shí)設(shè)3味藥相應(yīng)劑量的單味藥對(duì)照（10#～18#）。共計(jì)18個(gè)組方，見(jiàn)表1。

　　2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

　　精密稱(chēng)取適量的Ber，Pal，Evo，Rut，Pae，Dip，Gar對(duì)照品，用甲醇溶解，分別配制成100，100，25，25，20mg・L-1，1，2g・L-1的儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存，備用。2.3給藥與臟器采集

　　90只大鼠隨機(jī)分成18組，禁食12h后，以20μL・g-1的灌胃體積灌胃1～18號(hào)方戊己丸提取物溶液。灌胃后2h放血脫脊椎處死大鼠，迅速取出肝組織，生理鹽水洗凈表面血跡，用濾紙吸干表面水分。稱(chēng)重記錄，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2.4組織樣品預(yù)處理方法

　　將于-80℃冰箱中保存的給藥組肝組織及空白組肝組織取出，室溫下解凍。按3mL・g-1的量加入含10%氨水的生理鹽水在冰浴中勻漿。取270μL給藥組肝勻漿液，加30μL甲醇溶液，加30μL內(nèi)標(biāo)（Dip2mg・L-1，Gar20mg・L-1），加1470μL乙腈沉淀蛋白，以4℃，12000r・min-1離心15min，取上清液1500μL，25℃氮?dú)獯蹈伞�殘�(jiān)��?800μL含有1%甲醇的乙酸乙酯溶解，4℃，12000r・min-1離心15min，取上清液1440μL，25℃氮?dú)獯蹈伞�殘�(jiān)��?50μL50%乙腈再次溶解，3μL進(jìn)樣分析。

　　2.5樣品分析條件

　　2.5.1液相條件WatersAcquityUPLCSystem，ACQUITYUPLCBEHShieldRP18色譜柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.2%甲酸；采用梯度洗脫，單個(gè)樣品分析時(shí)間為7min；0～3.5min，2%～40%A；3.5～4.5min，40%～80%A；4.5～5.0min，80%～90%A；5.0～5.5min，80%～90%A；5.5～6.0min，90%～40%A；6.0～6.1min，40%～2%A；6.1～7.0min，2%A；流速0.4mL・min-1，柱溫35℃。

　　2.5.2質(zhì)譜條件采用電噴霧電離離子源（ESI），正負(fù)離子模式同時(shí)檢測(cè)，選擇MRM模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。其中Ber（m/z335/320），Pal（m/z352/336），Evo（m/z304/134），Rut（m/z288/115），Dip（m/z256/152）在正離子模式下檢測(cè)，毛細(xì)管電壓1.00kV，錐孔電壓50V，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度500℃，脫溶劑氣體流速800L・Hr-1，錐孔氣體流速50L・Hr-1，碰撞能20eV；負(fù)離子模式下檢測(cè)Pae（m/z525/449），Gar（m/z387/225），毛細(xì)管電壓2.50kV，錐孔電壓32V，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度500℃，脫溶劑氣體流速800L・Hr-1，錐孔氣體流速50L・Hr-1，碰撞能8eV。

　　2.6方法學(xué)評(píng)價(jià)

　　2.6.1方法專(zhuān)屬性將空白肝勻漿、加有檢測(cè)成份的空白肝勻漿及灌胃后的肝勻漿按2.4項(xiàng)下樣品處理方法進(jìn)樣對(duì)比分析。

　　2.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混標(biāo)溶液。其中Ber和Pal為20，50，100，200，400，600，800，1200，1600，2000μg・L-1；Evo和Rut為5，12.5，25，50，100，150，200，300，400，500μg・L-1；Pae為4，10，20，40，80，120，160，240，320，400μg・L-1。

　　取空白肝組織勻漿液270μL，加入30μL上述不同濃度的混標(biāo)溶液，加30μL內(nèi)標(biāo)溶液。按2.4項(xiàng)下樣品處理方法制備進(jìn)樣，以各樣品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸（權(quán)重1/X2），得回歸方程。

　　2.6.3日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度以空白肝組織樣品，根據(jù)線性范圍不同，選取高濃度混標(biāo)（Ber和Pal1600μg・L-1，Evo和Rut400μg・L-1，Pae320μg・L-1），中濃度混標(biāo)（Ber和Pal400μg・L-1，Evo和Rut100μg・L-1，Pae80μg・L-1），低濃度混標(biāo)（Ber和Pal50μg・L-1，Evo和Rut12.5μg・L-1，Pae10μg・L-1），按2.4樣品處理方法，制備成高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品。并將3個(gè)濃度樣品分別制備5份，連續(xù)檢測(cè)3d。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。

　　2.6.4回收率空白肝組織勻漿液，取30μL50%乙腈代替2.4項(xiàng)樣品處理方法中的內(nèi)標(biāo)，制備高中低3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度平行制備8份，記錄峰面積。并與相應(yīng)濃度實(shí)際進(jìn)樣量的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積相比，計(jì)算絕對(duì)回收率。

　　2.6.5穩(wěn)定性考察各代表成分及內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性包括：儲(chǔ)備液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性（儲(chǔ)備液在-80℃條件下保存4個(gè)月）；大鼠肝勻漿樣品中長(zhǎng)期穩(wěn)定性（肝勻漿在-80℃保存1個(gè)月）；大鼠肝勻漿樣品在前處理過(guò)程中的穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性（肝勻漿室溫下放置3h后提取及反復(fù)凍融一次后提取）；在復(fù)溶溶劑中的短期穩(wěn)定性（4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24h）。

　　2.7數(shù)據(jù)處理

　　質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Waters公司Masslynx4.1工作站進(jìn)行峰提取，峰積分等處理；采用內(nèi)標(biāo)法，用線性回歸方程計(jì)算各成分在肝臟中的濃度，權(quán)重因子1/X2，其中Ber，Pal，Evo，Rut選取Dip作為內(nèi)標(biāo)，Pae選取Gar作為內(nèi)標(biāo)；采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以柱狀圖（±s）來(lái)表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平設(shè)為α=0.05。選擇5種化合物濃度的平均值作為指標(biāo)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)方差和極差分析，確定對(duì)于各代表成分的最優(yōu)配伍組合及對(duì)全方的貢獻(xiàn)度、貢獻(xiàn)形式。3結(jié)果與分析

　　3.1方法學(xué)結(jié)果

　　3.1.1方法專(zhuān)屬性結(jié)果表明Ber，Pal，Evo，Rut，Pae以及內(nèi)標(biāo)Dip，Gar峰型良好，臟器中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)檢測(cè)沒(méi)有干擾，檢測(cè)成份相應(yīng)值較高，方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖1。

　　3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍按2.6.2下配制標(biāo)準(zhǔn)品并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，各成分線性范圍及回歸方程，見(jiàn)表2。

　　3.1.3日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度結(jié)果顯示，高中低3個(gè)濃度的Ber，Pal，Evo，Rut，Pae日內(nèi)準(zhǔn)確性為93%～105%，其精密度2.6%～13.2%；日間準(zhǔn)確性為96%～106%，其精密度為2.6%～12.1%。準(zhǔn)確度均在（100±10）%，精密度均在15%以?xún)?nèi)，符合生物樣品分析方法的要求，見(jiàn)表3。

　　3.1.4回收率結(jié)果顯示各代表成分高中低3個(gè)濃度的回收率穩(wěn)定，RSD均在15%以?xún)?nèi)，符合生物樣品分析方法的要求，見(jiàn)表4。

　　3.1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儲(chǔ)備液在-80℃下保存4個(gè)月各成份均穩(wěn)定未變。肝勻漿樣品在-80℃保存1個(gè)月所有被測(cè)成份峰面積基本未變。質(zhì)控樣品勻漿液在室溫下放置3h后提取，各成份峰面積基本不變。質(zhì)控樣品復(fù)溶液在4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24h，峰面積基本穩(wěn)定。質(zhì)控樣品凍融1次后再提取，各代表成分峰面積均有顯著降低，因此實(shí)驗(yàn)保證在解凍后均一次性處理。

　　3.2給藥肝組織樣品測(cè)定與分析

　　取2.4項(xiàng)下樣品分析，測(cè)定各配伍方中Ber，Pal，Evo，Rut，Pae給藥后2h在肝中的濃度。

　　3.2.1不同配伍方對(duì)Ber分布的影響統(tǒng)計(jì)各配伍方Ber濃度，結(jié)果顯示①黃連低劑量組Ber濃度大小為1#>10#>2#>3#，而吳茱萸用藥量為3#>2#>1#，提示與吳茱萸的用藥量成負(fù)相關(guān)，低劑量的吳茱萸可以促進(jìn)Ber在給藥2h后在肝中的濃度。②黃連中劑量組Ber濃度為6#>5#>11#>4#，吳茱萸用藥量為6#>5#>4#，提示與吳茱萸用藥量成正相關(guān)，高劑量的吳茱萸促進(jìn)Ber在給藥2h后在肝中的濃度。③黃連高劑量組配伍方中Ber濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.05），提示配伍方可以顯著提高Ber在給藥2h后在肝臟中的濃度，其中9#>7#>8#，見(jiàn)圖2。

　　3.2.2不同配伍方對(duì)Pal分布的影響統(tǒng)計(jì)各配伍方Pal濃度，結(jié)果顯示①黃連低劑量組配伍方中Pal濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可以顯著提高Pal在給藥2h后在肝中的濃度。②黃連中劑量組配伍方中Pal濃度均小于同劑量單味藥方，提示配伍方抑制了Pal的在肝中的濃度；其中6#>4#>5#，而白芍用藥量為5#>4#>3#，與白芍的用藥量成負(fù)相關(guān)，提示白芍可以抑制Pal給藥2h后在肝中的濃度。③高劑量組配伍方Pal濃度均顯著大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可以顯著提高Pal在給藥2h后在肝中的濃度，見(jiàn)圖3。

　　3.2.3不同配伍方對(duì)Evo分布的影響統(tǒng)計(jì)各配伍方Evo濃度，結(jié)果顯示①吳茱萸低劑量組Evo濃度為7#>4#>13#>1#，黃連與白芍的用藥量為7#>4#>1#，提示與黃連和白芍的用藥量成正相關(guān)，高劑量的黃連與白芍可以促進(jìn)Evo在給藥2h后在肝中的濃度；②吳茱萸中劑量組配伍方中Evo濃度均小于同劑量單味藥方，其中8#>2#>5#，白芍的用量為5#>2#>8#，提示與白芍的用量成負(fù)相關(guān)，白芍抑制了Evo在給藥2h后在肝中的濃度；③高劑量組配伍方Evo濃度均小于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方抑制Evo在給藥2h后在肝中的濃度；其中9#>6#>3#，黃連的用藥為9#>6#>3#，提示與黃連的用藥成正相關(guān)，見(jiàn)圖4。

　　3.2.4不同配伍方對(duì)Rut分布的影響統(tǒng)計(jì)各配伍方中Rut濃度，結(jié)果顯示①低劑量組配伍方中Rut濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可顯著促進(jìn)Rut給藥2h后在肝中的濃度；②中劑量組配伍方Rut濃度均小于同劑量單味藥方，其中8#>2#>5#，同時(shí)白芍的用量為5#>2#>8#，提示與白芍的用量成負(fù)相關(guān)，白芍抑制Rut在給藥2h后在肝中的濃度；③高劑量組配伍方中Rut濃度均大于同劑量單味藥方（P<0.01），提示配伍方可以提高Rut在給藥2h后在肝中的濃度，見(jiàn)圖5。

　　3.2.5不同配伍方對(duì)Pae分布的影響統(tǒng)計(jì)各配伍方中Pae濃度，結(jié)果顯示①白芍低、中劑量組單味藥組方（16#，17#）中Pae濃度均低于定量下限，而配伍方中Pae濃度均高于定量下限，提示白芍低、中劑量時(shí)配伍方可以顯著提高Pae在給藥2h后在肝中的濃度；②其中白芍中劑量組為9#>2#>4#，吳茱萸用量為9#>2#>4#，提示與吳茱萸用量成正相關(guān)；③高劑量組5#Pae濃度低于定量下限，配伍方中7#高于18#（P<0.01），3#低于18#，見(jiàn)圖6。

　　3.2.6各代表成分正交方差分析、極差分析結(jié)果以各代表成分在2h肝濃度的平均值為指標(biāo)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)方差分析及極差分析確定相對(duì)于各代表成分的最優(yōu)組合，以及各因素間的主次關(guān)系、貢獻(xiàn)形式以及貢獻(xiàn)度大小，見(jiàn)表5。貢獻(xiàn)度表示各因素對(duì)代表成分在肝中濃度的影響程度，貢獻(xiàn)度越大說(shuō)明其對(duì)代表成分分布濃度影響越大，貢獻(xiàn)形式分為促進(jìn)分布（+，正相關(guān)）與抑制分布（-，負(fù)相關(guān)），由此得到的影響因素的大小排序即為貢獻(xiàn)度排序。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果中可以看出，黃連對(duì)Ber，Pal，Pae在肝中濃度起主要作用，其次為吳茱萸和白芍；且黃連與Ber，Pal為正相關(guān)，即增大黃連的用量可以增大Ber，Pal在肝中的濃度，黃連用量與Pae沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性；對(duì)于Evo，三味藥的主要貢獻(xiàn)度為吳茱萸>黃連>白芍，其中吳茱萸對(duì)Evo為負(fù)相關(guān)，黃連對(duì)Evo為正相關(guān)，即增大黃連的用量，減少吳茱萸的用量可以增大Evo的濃度大小；對(duì)于Rut，三味藥的主要貢獻(xiàn)度為吳茱萸>白芍>黃連，且吳茱萸與Rut成正相關(guān)，及增大吳茱萸的用量，可以提高Rut在肝中的濃度。當(dāng)黃連-吳茱萸-白芍12∶6∶6時(shí)可使Ber，Pal，Evo，Rut濃度最大；使Pae濃度最大的配伍比為黃連-吳茱萸-白芍12∶1∶6。因此，綜合考慮5個(gè)代表成分，得出戊己丸在2h在肝臟中濃度最大的最優(yōu)配伍比為黃連-吳茱萸-白芍12∶6∶6。4小結(jié)與討論

　　組織中的藥物通常因?yàn)楹�量較低而不易測(cè)出，為此，本實(shí)驗(yàn)采用了液質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)手段，同時(shí)選擇了較傳統(tǒng)HPLC有著更高柱效與分離度的UPLC液相系統(tǒng)及1.7μm粒徑的UPLC柱，大大縮短了分析時(shí)間。比較了各成份在ESI與APCI2種不同電離模式下響應(yīng)情況，選擇了ESI離子源。同時(shí)選擇Dip，Gar雙內(nèi)標(biāo)來(lái)分析中正負(fù)離子模式同時(shí)監(jiān)測(cè)。

　　被測(cè)成份Ber，Pal，Evo，Rut均具有堿性，堿化樣品有助于提高整個(gè)處理過(guò)程的回收率，因此本實(shí)驗(yàn)采用含10%氨水的生理鹽水勻漿，堿化勻漿液。為了達(dá)到良好的檢測(cè)效果，同時(shí)避免組織中雜質(zhì)對(duì)樣品和儀器造成的干擾和污染，樣品預(yù)處理通過(guò)蛋白沉淀后2次復(fù)溶，在保證方法穩(wěn)定可靠的同時(shí)，確保了將蛋白及極性較大的內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾和污染降至最低，同時(shí)延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。

　　肝組織及其勻漿液中含有大量藥物代謝酶，本實(shí)驗(yàn)采取多種措施以保證各檢測(cè)成份在分析過(guò)程中的穩(wěn)定性。包括臟器取出稱(chēng)重后立即放于-20℃冰箱中并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存直至勻漿；肝勻漿后立即進(jìn)行提取處理，為防止反復(fù)凍融，減少1次勻漿的數(shù)量，確保一次性處理完畢；樣品復(fù)溶后立即放置于-4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中；所用標(biāo)準(zhǔn)溶液均按每次實(shí)驗(yàn)的用量計(jì)算分裝，并于-80℃冰箱中保存，解凍后均一次性使用。

　　根據(jù)前期藥代動(dòng)力學(xué)研究得到的血藥濃度-時(shí)間曲線[4]，本實(shí)驗(yàn)選擇2h作為考察時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)各代表成分在組織和血液之間的分布基本已達(dá)到平衡。根據(jù)各代表成分濃度之間的比較分析，結(jié)果顯示給藥2h后①對(duì)于Ber：隨著黃連用量的增大，Ber在肝中的濃度逐漸增大。大劑量配伍方可以顯著提升Ber在肝中的濃度；黃連用量為低、中劑量時(shí)，Ber的分布均與吳茱萸有關(guān)，低劑量的吳茱萸對(duì)低劑量黃連組Ber的濃度有著促進(jìn)作用，而對(duì)中劑量黃連組為抑制作用。②對(duì)于Pal：其濃度大小均與黃連的用量成正相關(guān)，當(dāng)黃連用量為低、高劑量時(shí)，配伍可以顯著提高Pal的濃度；黃連中劑量時(shí)，配伍略微抑制Pal的分布，主要抑制因素為白芍，隨著白芍用量增大，抑制作用增強(qiáng)。③對(duì)于Evo：隨著吳茱萸用量的增加，Evo在肝中的濃度增大，但配伍方對(duì)Evo濃度的抑制作用隨之加大；當(dāng)吳茱萸低劑量時(shí)，低劑量的黃連和白芍Evo的作用為抑制，而增大二者的用量，則促進(jìn)Evo在肝中的濃度；吳茱萸中劑量時(shí)，白芍為主要作用因素，隨白芍用量增大Evo濃度減小，吳茱萸高劑量時(shí)，黃連為主要作用因素，隨著黃連用量減少，Evo濃度減小。④對(duì)于Rut，隨著吳茱萸用量的增大，Rut濃度增大，當(dāng)吳茱萸用量為低、高劑量時(shí)，配伍方對(duì)Rut濃度大小起促進(jìn)作用，吳茱萸用量為中劑量時(shí)，配伍方對(duì)Rut起抑制作用，且白芍為主要因素，隨白芍用量增加，對(duì)Rut的抑制作用增加。⑤對(duì)于Pae：白芍用量低、中劑量時(shí)，配伍方可以顯著提高Pae的濃度，且中劑量時(shí)隨著吳茱萸用量的增加，Pae濃度加大。

　　通過(guò)正交方差分析與極差分析，結(jié)果顯示，增大黃連的用量可以增大Ber，Pal，Evo在肝中的濃度；增大吳茱萸的用量可以增大Rut在肝中的濃度，降低Evo在肝中的濃度；初步得到戊己丸在肝中濃度最大的配伍組合為黃連-吳茱萸-白芍12∶6∶6。

　　本實(shí)驗(yàn)僅從組織分布的角度初步探索了戊己丸的配伍規(guī)律，然而中醫(yī)藥理論博大精深，影響藥物體內(nèi)分布的因素環(huán)節(jié)又復(fù)雜多樣。因此，如何借助藥代動(dòng)力學(xué)的技術(shù)和手段，從多層次多角度去探討方劑的配伍機(jī)制，仍是筆者今后努力的方向。

　　[參考文獻(xiàn)]

　　[1]中國(guó)藥典.一部[S].2010：637.

　　[2]王婭杰，董宇，朱曉新.戊己丸提取物不同配伍方對(duì)豚鼠離體結(jié)腸運(yùn)動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（20）：2161.

　　[3]宮海民，王兆淦，段文卓.戊己丸鎮(zhèn)痛、抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，1998，5（3）：147.

　　[4]鮑天冬.戊己丸提取物不同配伍的藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[D].北京：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，2007.

　　[5]翁小剛，李玉潔，楊慶，等.戊己丸不同配伍比方對(duì)大鼠體外CYP3A1/3A2酶活性的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（9）：1164.

　　[6]翁小剛，李玉潔，楊慶，等.戊己丸不同配比方對(duì)大鼠體外CYP1A2酶活性的影響[J].世界華人消化雜志，2010，18（6）：586.

　　[7]王怡薇，王彥禮，李玉潔，等.戊己丸不同配伍對(duì)代表成分吸收及肝臟攝取的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（4）：793.

　　[8]劉建平，李高.生物藥劑學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.