摘要：試驗以涼山半細(xì)毛羊為研究對象，采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-1基因的CDS全序列，生物信息學(xué)方法深入分析其序列。結(jié)果表明，IGFBP-1基因的CDS序列為792 bp，編碼263個氨基酸，與牛、人、鼠的CDS同源性分別為97%、76%和74%，氨基酸序列同源性分別為97%、69%和71%，GenBank登錄號為FJ589639.1;IGFBP-1基因的氨基酸分子量為27.8 kD，理論等電點(pI)為5.99;進(jìn)化分析顯示與牛、山羊等哺乳動物關(guān)系較近，與雞、魚類等親緣關(guān)系較遠(yuǎn);IGFBP-1基因存在明顯的疏水性區(qū)域和親水性區(qū)域，有一個信號肽、一個跨膜區(qū)、16個磷酸化位點、6個N-糖基化位點和8個O-糖基化位點;二級結(jié)構(gòu)分析顯示無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-折疊區(qū)域分別為61.98%、24.33%、13.69%;三級結(jié)構(gòu)分析顯示存在IGFBP_N和甲狀腺球蛋白-Ⅰ型功能域。為進(jìn)一步研究綿羊IGFBP-1基因的功能奠定基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：農(nóng)業(yè)期刊投稿,IGFBP-1基因,克隆,綿羊

　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.028

　　Abstract： Using Liangshan semi-fine wool sheep as material， the whole CDS sequence of IGFBP-1 gene was cloned with RT-PCR and analyzed its sequences by bioinformatics. The results showed that the CDS sequence of IGFBP-1 gene was 792 bp， encoding 263 amino acids. The CDS homology with bovine，human and rat was 97%， 76% and 74%， respectively. The amino sequence homology was 97%， 69% and 71%， respectively. Its accession number in GenBank was FJ589639.1. Its amino molecular weight was 27.8 kD. The theoretical isoelectric point(pI) was 5.99. The phylogenetic analysis showed that it was close to cattle and goat and far from chicken，fish，etc. The IGFBP-1 had obvious hydrophobic and hydrophilic region， a signal peptide， a transmembrane region，16 sites of phosphorylation， 6 sites of N- glycosylation and 8 sites of O-glycosylation. The random coil， α-helix and β-sheet region in secondary structure was 61.98%， 24.33%， 13.69%， respectively. The tetiary structure analysis showed that it had a IGFBP_N domain and a thyroglobulin-Ⅰ type of domain. It will provide a scientific basis for further studying the function of IGFBP-1 gene in sheep.

　　Key words： IGFBP-1 gene; clone; sheep

　　胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族(IGFBPs)的成員之一，調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子Ⅰ和胰島素樣生長因子Ⅱ的促有絲分裂和新陳代謝作用[1]，在低氧或饑餓、營養(yǎng)不良、糖尿病等不利條件下，哺乳動物外周和肝臟中IGFBP-1 mRNA水平顯著增加[2]，降低IGFBP-1的水平，會導(dǎo)致葡萄糖耐受性降低、血壓升高，甚至引起肥胖[3-5]，IGFBP-1能抑制依賴于IGF-I的細(xì)胞生長和分化[6]，高表達(dá)使生物池中IGF-I的可用量減少[7]，引起動物機(jī)體(如鼠)的出生體質(zhì)量下降[8]。

　　Ou等[9]運用PIRA-RFLP技術(shù)檢測北京油雞的IGFBP-1基因5′的單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與北京油雞群體的生長有密切關(guān)系，趙秀華等[10]采用SSCP技術(shù)檢測京海黃雞的IGFBP-1基因外顯子的單核苷酸多態(tài)性，SNP位點對京海黃雞生長性狀具有一定的影響。有關(guān)綿羊IGFBP-1基因的序列分析、單核苷酸多態(tài)性等報道較少，本研究以涼山半細(xì)毛羊為研究對象，克隆了IGFBP-1基因的全CDS序列，利用生物信息學(xué)方法分析CDS序列及相應(yīng)的氨基酸序列，為進(jìn)一步研究該基因在綿羊生長發(fā)育過程中的調(diào)控以及標(biāo)記的輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　以四川省涼山州布拖縣的涼山半細(xì)毛羊原種場7～9月齡的涼山半細(xì)毛羊母羊為試驗材料，采用頸靜脈放血，宰殺后10 min內(nèi)收集肝臟組織，浸泡于Sample Protector(寶生物)試劑中，置放于液氮中保存，帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 引物設(shè)計

　　參照NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布普通牛(Bos Taurus)的IGFBP-1基因(NM_174554)的mRNA序列，采用Prime 5.0軟件設(shè)計引物，Oligo 6.0進(jìn)行引物評價，采用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具檢索比對以驗證引物特異性，IGFBP-1引物序列為F：5′-TGGCGATGCCCGAAGTCCT-3′，R：5′-GCATCTGTTTT 　　CAGTTCTGTAAG-3′，引物由大連寶生物公司合成。

　　1.3 總RNA的提取

　　取涼山半細(xì)毛羊肝臟組織約100 mg，迅速放入預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至組織被研磨成粉末狀，提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，核酸蛋白檢測儀檢測RNA提取的濃度與純度，提取的RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4 RT-PCR擴(kuò)增

　　反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s終止反應(yīng)。以合成的第一條cDNA鏈為模板，以IGFBP-1基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，62 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。

　　1.5 RT-PCR產(chǎn)物克隆

　　將回收的RT-PCR產(chǎn)物與PMD 18-T載體連接，根據(jù)凝膠電泳或核酸蛋白儀檢測后的濃度及載體與片段分子大小來計算其摩爾比。輕輕蝸旋離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心，將混合反應(yīng)液置于16 ℃水浴中過夜連接。用滅菌牙簽挑取單個白色菌落，接種于含有氨芐的1.5 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，吸取1 μL菌液作模板，依據(jù)RT-PCR擴(kuò)增的體系和條件進(jìn)行PCR鑒定，通過1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測目的條帶。據(jù)菌液PCR檢測結(jié)果，吸取含有目的條帶的1 mL菌液，送往Invitrogen公司測序。

　　1.6 生物信息學(xué)分析

　　將測序結(jié)果與測序峰圖結(jié)合進(jìn)行校對，尋找基因的起始密碼子與終止密碼子，確定基因的編碼區(qū)序列。用NCBI的Blast服務(wù)器和Clustal W軟件進(jìn)行序列的同源性分析。核酸序列與其他物種比對后，利用Expasy服務(wù)器(http：//au.expasy.org/tools/)相關(guān)軟件預(yù)測各個基因的氨基酸序列的分子量、等電點和氨基酸組成等，將序列提交到ExPASy ScanProsite、HNN、SWISS-MODEL服務(wù)器，預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化位點、N-磷酸化位點、O-磷酸化位點、跨膜區(qū)、信號肽、疏水性、二級結(jié)構(gòu)和功能域等。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增

　　涼山半細(xì)毛羊肝臟組織中提取到的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后可以清晰地觀察到3條帶，如圖1所示，以遷移率從大到小依次是5S rRNA、18S rRNA、28S rRNA，28s條帶亮度大約為18S條帶的2倍，5S條帶亮度較低，總RNA樣品完整、降解較少、質(zhì)量良好。以涼山半細(xì)毛羊的肝臟組織的cDNA為模板，用IGFBP-1基因的引物擴(kuò)增，得到的長度約800 bp，凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。

　　2.2 序列分析

　　根據(jù)正反測序進(jìn)行校正，采用DNAMAN去除載體序列和尋找上下游引物序列，確定各個基因編碼氨基酸的CDS區(qū)域，IGFBP-1基因的完整CDS序列長度為792 bp，共編碼263個氨基酸。利用NCBI中的Blast程序比對克隆的綿羊IGFBP-1基因與近源物種的同源性。同源性分析表明，IGFBP-1基因與牛、人、鼠的CDS區(qū)的同源性分別為97%、76%和74%，氨基酸序列同源性分別為97%、69%和71%;同源性比對結(jié)果顯示克隆的基因即為綿羊的IGFBP-1，基因?qū)�PCR擴(kuò)增得到的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，登錄號為FJ589639.1。利用BioEdit軟件對此次試驗克隆得到的IGFBP-1基因的CDS編碼區(qū)的堿基組成成分分析，IGFBP-1基因的A、C、G和T等4種堿基組成含量分別為20.96%、30.81%、29.42%和18.81%，單鏈分子量為241.9 kD，雙鏈分子量為482.9 KD;IGFBP-1的氨基酸分子量為27.8 kD，理論等電點為5.99。

　　2.3 IGFBP-1基因的分子進(jìn)化

　　從NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫下載山羊、豬、牛、鼠、人、雞和魚類等物種的IGFBP-1基因的氨基酸序列，用Mega 6.06軟件以Neighbor-Joining程序構(gòu)建IGFBP-1基因的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。IGFBP-1基因與其他物種的進(jìn)化關(guān)系跟傳統(tǒng)的分類比較一致，綿羊與山羊關(guān)系最近，最先聚合，隨著親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近逐步與牛、豬、人和鼠等哺乳動物聚為一支，再與雞聚合，最后與來源于水生魚類的一支聚合。

　　2.4 蛋白質(zhì)特性預(yù)測

　　2.4.1 疏水性分析 蛋白質(zhì)的疏水性分析采用ExPASy在線平臺的ProtScale程序計算綿羊IGFBP-1的疏水性圖譜，如圖4所示。IGFBP-1的N段區(qū)域，存在明顯的疏水性區(qū)域，而在N段及中部區(qū)域存在明顯的親水性區(qū)域。因此，預(yù)測IGFBP-1的中部區(qū)域是與IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因的結(jié)合部位，依據(jù)IGFBP-1N段的明顯疏水性區(qū)域，在該位置可能存在信號肽。

　　2.4.2 信號肽分析 根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性分析，IGFBP-1可能存在信號肽，將IGFBP-1的氨基酸序列提交到SignalP 3.0服務(wù)器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。如圖5所示，結(jié)果表明，IGFBP-1蛋白質(zhì)的N段存在信號肽的概率為0.985，信號肽的長度為25個氨基酸殘基，切割位置為Gly-Ala之間。

　　2.4.3 跨膜區(qū)分析 聯(lián)網(wǎng)到“http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html”進(jìn)行蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)預(yù)測，如圖6所示。分析表明，IGFBP-1存在兩個跨膜區(qū)，分別位于9～27和57～78位置處，9～27這個跨膜區(qū)剛好位于信號肽位置，因而該基因僅存在57～78位置處的一個跨膜區(qū)。 　　2.4.4 磷酸化和糖基化位點 利用NetPhos 2.0在線磷酸化位點預(yù)測服務(wù)器，對克隆的IGFBP-1的磷酸化位點預(yù)測(http：//www.cbs.dtu.dk/services/)如圖7所示。IGFBP-1基因中共發(fā)現(xiàn)16個磷酸化位點，分別為Ser(11)、Thr(4)和Tyr(2)。

　　利用NetNGlyc1.0及NetOGlyc3.1服務(wù)器，對克隆的IGFBP-1的分子進(jìn)行N-和O-糖基化位點預(yù)測(http：//www.cbs.dtu.dk/services/)。由圖7可知，IGFBP-1氨基酸序列中共6個N-糖基化位點，分別位于141、157、161、209、211、260等位置;O-糖基化位點的預(yù)測如圖3.11，IGFBP-1氨基酸序列中共8個O-糖基化位點，分別位于100、108、109、115、117、120、121、122等位置。

　　2.5 二級結(jié)構(gòu)分析

　　利用HNN在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器對IGFBP-1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)，如圖7所示。IGFBP-1以無規(guī)卷曲為主，其次為α-螺旋，β-折疊最少。IGFBP-1的無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊區(qū)域分別占61.98%、24.33%、13.69%。

　　2.6 蛋白質(zhì)功能域預(yù)測及分析

　　將序列遞交到ExPASy ScanProsite(http：//www.expasy.org/tools/scanprosite/)結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的查找與分析，如圖8所示。克隆的IGFBP-1的N端具有一個IGFBP_N功能域序列，位于28-109;在C端，具有一個甲狀腺球蛋白-Ⅰ型域，位置為177-255，在該域中，具有3個二硫鍵，位置為180-210、221-232、234-255，同時還具有大量的N-豆蔻酰化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點和蛋白激酶C等磷酸化位點;在IGFBP-1(197-203，Kag.Dkl.Y)中具有酪氨酸激酶磷酸化活化位點、一個細(xì)胞粘附序列(250-252，RGD)和一個酰胺化位點(239-242，sGKR)。

　　3 小結(jié)與討論

　　細(xì)胞的生長、繁殖和存活依賴于細(xì)胞間的動態(tài)分子調(diào)節(jié)過程，在這種復(fù)雜的生命活動過程中，蛋白質(zhì)分子扮演著重要的中介角色，在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、代謝物、磷脂、碳水化合物及核酸之間發(fā)揮極其活躍的作用。人類基因組直接得到的初始蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并不能充分地解釋蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的多種功能及其相互調(diào)節(jié)機(jī)制，幾乎所有的蛋白質(zhì)都要經(jīng)過各種形式的修飾[11]，在線預(yù)測顯示IGFBP-1存在大量的磷酸化和糖基化等修飾過程，IGFBP-1是羊水中IGF-Ⅰ的主要結(jié)合蛋白，生理作用依賴于不同的磷酸化[12，13]，IGFBP-1的磷酸化提高了與IGF-Ⅰ的親和力，調(diào)節(jié)IGF-Ⅰ的活性，特別是IGF-Ⅰ關(guān)于胎兒與胎盤的生長[14]。人的Ser101是一個獨特的磷酸化位點，與IGF-Ⅰ的結(jié)合極為重要，Ser19的磷酸化也能提高與IGF-Ⅰ的結(jié)合，而在Ser169和Ser98的磷酸化位點并不與IGF-Ⅰ的結(jié)合表現(xiàn)為相關(guān)性，IGFBP-1的Ser98、Ser101、Ser119和Ser169等磷酸化位點是胎兒適應(yīng)性應(yīng)答于低氧和營養(yǎng)限制的一種新機(jī)制[15]。

　　蛋白質(zhì)的糖基化是低聚糖以糖苷的形式與蛋白上特定的氨基酸殘基共價結(jié)合的過程，蛋白質(zhì)糖基化可以按照氨基酸和糖的連接方式分為四類：O-糖基化、N-糖基化、C-甘露糖化以及GPI錨定連接[16]。O-糖基化多發(fā)生在臨近脯氨酸的絲氨酸或蘇氨酸殘基上，糖基化位點處的蛋白多為β構(gòu)型，O-多聚糖以逐步加接單糖的形式形成低聚糖。N位糖基化是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由糖基轉(zhuǎn)移酶催化，在內(nèi)分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白的天冬酰氨殘基的氨基上結(jié)合寡糖的過程，一般認(rèn)為N-糖基化發(fā)生在蛋白Asn-Xaa-Ser/Thr序列上[17]，少數(shù)情況下Asn-Xaa-Cys序列也作為糖基化位點[16]。IGFBP-1的氨基酸序列中存在6個N-糖基化位點和8個O-糖基化位點。

　　IGFBP-1在保守的N-端區(qū)域存在12個Cys，形成6個二硫鍵，其二硫鍵是以相鄰的2個Cys依次而構(gòu)成，形成IGFBP-1的第一亞域，在C-端的保守區(qū)域內(nèi)存在6個Cys，以相鄰兩個Cys依次而構(gòu)成3個二硫鍵，構(gòu)成第二亞域，在綿羊的IGFBP-1基因的氨基酸序列的二硫鍵跟人的研究一致[18，19]，經(jīng)二硫鍵折疊形成穩(wěn)定精細(xì)的IGFBP-1的球狀結(jié)構(gòu)，保證了與IGFs結(jié)合的親和力。在IGFBP-1N-端具有一個完整IGFBP_N功能域和在C-端具有一個甲狀腺球蛋白-1，從而表現(xiàn)出IGFBP-1與IGF-I結(jié)合的功能以及自身的獨特功能。

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