摘要：通過提取大豆DNA，采用浸胚法在不同的濃度和溫度下來處理番茄種子，觀察后代植株一系列生理指標的變化，通過用紫外分光光度法測定后代植株葉綠素含量，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對植株同工酶(SOD)進行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的番茄種子，后代植株性狀產(chǎn)生變異：葉綠素總含量與對照相比出現(xiàn)增加，其中DNA濃度為136.50 μg/mL經(jīng)4 ℃浸泡避光處理的番茄種子總?cè)~綠素含量變化最大，比對照增加了116%;同工酶(SOD)譜帶一致，沒有新的譜帶出現(xiàn)，但酶活發(fā)生了變化。

　　關(guān)鍵詞：作物生成論文,番茄,浸胚法,外源DNA,生理指標

　　Trait Variation of Offsprings from Tomato Transfermed by Exogenous DNA

　　DING Jin-ping

　　(Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions，College of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，Henan，China)

　　Abstract： Tomato seeds were treated in different concentrations of soybean DNA and temperature. Changes of a series of physiological indexes of the offsprings were observed. The content of chlorophyll of offsprings was determined by uv spectrophotometry. Polypropylene gel electrophoresis(PAGE)was used to analyze the peroxidase isozyme(SOD) of plants. Results showed that content of total chlorophyll was increased compared with contrast. When the DNA concentration was 136.50 μg/mL and tomato seeds were soaked lightly at 4 ℃， content of total chlorophyll had the biggest changes with increase of 116%. Band of peroxidase isozyme (SOD) was consistent. There was no new band， but the activity of enzyme was changed.

　　Key words： tomato; dip embryo law; exogenous DNA; physiological indicators

　　番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)為茄科，茄屬。它是一種含有多種維生素和營養(yǎng)成分的蔬菜，據(jù)營養(yǎng)學(xué)家研究測定，每人每天食用50～100 g鮮番茄，即可滿足人體對幾種維生素和礦物質(zhì)的需要。另外，番茄中的番茄紅素具有很強的抗氧化活性，能夠抗衰老、降低心血管疾病的危險性和防癌等。但其蛋白質(zhì)含量較少，如能將大豆的基因轉(zhuǎn)入到番茄中，創(chuàng)造高蛋白含量的番茄品種，既能豐富其營養(yǎng)價值，又能拓寬番茄的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，豐富其遺傳類型，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源。

　　利用外源DNA直接導(dǎo)入技術(shù)培育農(nóng)作物新品種或創(chuàng)建新種質(zhì)是20世紀70年代以來在中國創(chuàng)立的一個育種新途徑。它以植物為受體，帶有目的性狀的外源遺傳物質(zhì)(總DNA)或目的基因為供體，進行直接導(dǎo)入，既不同于載體轉(zhuǎn)化的基因工程技術(shù)，也有別于通過有性雜交實現(xiàn)植物間基因交流的傳統(tǒng)育種方式。種胚浸泡法[1](即浸胚法)是以供體的DNA溶液浸泡受體干種子的胚或萌動的種子，將外源DNA導(dǎo)入受體細胞，達到轉(zhuǎn)化目的的一種外源DNA 直接導(dǎo)入植物的方法，具有無需特殊設(shè)備，可行、簡便、易操作的特點。浸胚法與其他育種方法相比有自己的優(yōu)點：①導(dǎo)入體是含有目的性狀基因的總DNA，有可能一次導(dǎo)入達到改良多基因控制的數(shù)量性狀的目的，不需事先分離、提純和克隆目的性狀基因，導(dǎo)入操作方法簡便易行，勿需特殊設(shè)備和條件。②不受供體種類限制，植物和動物等均可作為外源DNA的供體，具有廣闊的應(yīng)用前景。③能夠?qū)崿F(xiàn)遠緣雜交不親和植物間的遺傳物質(zhì)(基因)重組，獲得各種有價值的變異新類型，豐富育種資源。

　　通過將供體外源總DNA片段導(dǎo)入受體中可以研究一些具有重大經(jīng)濟價值的農(nóng)作物，而遺傳背景差異極大的農(nóng)藝性狀是否能夠通過 DNA片段進行轉(zhuǎn)移，是否為單基因或單基因控制的多基因決定的性狀，從而為近期的基因工程課題選擇打下了基礎(chǔ)。有研究[2-4]表明，外源DNA導(dǎo)入作物可以獲得10-3～10-1的遺傳變異率。

　　1材料與方法

　　1.1供試材料

　　供體：大豆(豫豆29號)。

　　受體：番茄(MM)。

　　1.1.1試劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)、巰基乙醇、氮藍四銼、甲硫氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、過硫酸銨。

　　1.1.2主要儀器臺式冷凍離心機(Eppendorf 5417C/R型)，快速核酸/蛋白析儀，電泳儀(EPS601型)。 　　1.2方法

　　1.2.1外源DNA的誘導(dǎo)

　　1)大豆DNA的提取方法。采用CTAB法[5]，總DNA的純度鑒定采用紫外吸收光譜，測得DNA濃度為136.50 μg/mL。測定結(jié)果表明，純化后的供體總DNA溶液純度符合誘導(dǎo)條件，用蒸餾水溶液配制DNA溶液。配制的DNA終濃度分別為136.50、 273.00、341.25、477.700、546.00、682.50 μg/mL。

　　2)外源DNA的導(dǎo)入方法。用上述配制的同體積的不同濃度的DNA溶液分別浸泡番茄種子，并分別在4 ℃(A)、20 ℃(B)、25 ℃(C)和35 ℃(D)溫度下暗處理24 h，同時用相同體積的雙蒸水(ddH2O)浸泡番茄種子作對照，將種子在田間種植，重復(fù)3次。

　　1.2.2誘導(dǎo)后生理指標的測定方法

　　1)葉綠素含量測定方法。葉綠素含量的測定用乙醇浸提法[6]。首先取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2 g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3 mL 95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10 mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5 min。然后取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100 mL 棕色容量瓶中;用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中，用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入棕色容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至100 mL，搖勻。取葉綠體色素提取液在波長663、645、652 nm下測定吸光度，以95%乙醇為空白對照。求得吸收率，并根據(jù)公式計算出葉綠素a和葉綠素b的含量。在葉綠素測定時要注意兩點：光照會造成葉綠素的迅速破壞，因此提取時要在黑暗中進行，動作要快[7]。注意在酸性條件下，葉綠素也會遭到破壞[8]。按照Arnon公式，分別計算植物材料中葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量。葉綠素Ca=12.7 A663 -2.69 A645，葉綠素Cb=22.9 A645-4.68A663，總?cè)~綠素C=20.21A645+8.02A663。

　　2)同工酶(SOD)測定方法。①同工酶的提取：采用李合生[9]的方法并略微改動。把取得的材料洗凈吸干水分，將0.5 g葉片加入1 mL 14 ℃預(yù)冷的pH 為7.8 PBS，于冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到10 mL試管中，然后加緩沖液至5 mL，取2 mL與離心管中離心15 min，吸取上清液，分管裝編號后放入20 ℃冰箱中冷藏備用。

　　②電泳：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法[10]，上層濃縮膠濃度4%、pH 6.7，下層分離膠濃度為10%、pH 8.9，每板15個進樣孔，每孔上樣20 uL，以pH 8.3的Tris-甘氨酸溶液為電極緩沖液、0.005%的溴酚藍作指示劑，在溫度為4 ℃下進行電泳，電泳開始時電流要小，控制在15～20 mA，30 min后加大電流至30～50 mA，約2～3 h，待指示劑移到接近凝膠正極末端停止電泳。

　　③凝膠染色[11]。染色液 Ⅰ：0.200 3 g NBT，加50 mL蒸餾水溶解后，定容到100 mL;染色液Ⅱ：0.001 g核黃素，0.045 9磷酸二氫鈉，1.186 g磷酸氫二鈉，0.418 mL四甲基乙二胺，加50 mL蒸餾水定容到100 mL;染色液Ⅲ：0.002 9 g乙二胺四乙酸，0.062 4 g磷酸二氫鈉，1.647 g磷酸氫二鈉，加50 mL蒸餾水溶解后，定容到100 mL;將剝出的凝膠板浸入染色液Ⅰ中，黑暗中浸泡20 min，取出凝膠至染色液Ⅱ中，黑暗中浸泡15 min，再取出轉(zhuǎn)移至染色液Ⅰ中，置于日光燈下光照20～30 min，直至藍色背景上出現(xiàn)清晰透明的SOD譜帶。倒掉染液并用蒸餾水洗凈，照相，繪制圖譜，并測量酶譜帶相對遷移率Rf值。

　　Rf=

　　2結(jié)果與分析

　　2.1大豆DNA的電泳檢測結(jié)果

　　提取的大豆DNA電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，大豆DNA約為20 000 bp。

　　2.2番茄葉片葉綠素含量的測定

　　由表1可知，試驗組番茄植株的葉綠素含量發(fā)生了變化，與對照組相比，葉綠素含量增加了，其中DNA濃度為136.50 g/mL經(jīng)4 ℃浸泡避光處理的番茄種子葉綠素含量變化最大，比對照組高116%，其余其他條件處理的番茄種子葉綠素含量均增加。還可以看出，在DNA濃度為 273.00 g/mL的條件下經(jīng)20 ℃浸泡避光處理的番茄種子葉綠素a的含量比對照低6%，其余的均比對照組高，但是變化量不是很明顯;試驗組植株葉片葉綠素b的含量均比對照組高，而且變化明顯。

　　2.3番茄同工酶SOD分析

　　由圖2可知，變異株與對照株的同工酶遷移率Rf1=0.48、Rf2=0.6具有相同的譜帶;變異株的同工酶酶譜中，3-C即DNA濃度為341.25 μg/mL經(jīng)過25 ℃處理的譜幅寬，顏色深，酶活性強;1-C即DNA濃度為136.50 μg/mL經(jīng)過25 ℃處理的譜帶顏色淺，酶活性弱。其余的酶譜帶與對照相比差異不大。根據(jù)上述所知，后代變異植株的同工酶確實發(fā)生了變化。

　　3討論

　　浸胚法導(dǎo)入外源DNA已經(jīng)得到證實，王邕等[12]報道了外源DNA導(dǎo)入玉米引起后代性狀變異，觀察D0代變異株及D1代植株的性狀，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)對D0代植株及其供體進行了同工酶分析，從而初步證實了大豆DNA的功能片段已整合到了受體基因組內(nèi)并得到了表達。劉傳雪等 [13]報道了應(yīng)用浸胚法轉(zhuǎn)化寒地水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)后代產(chǎn)生了變異。國內(nèi)外采用外源總DNA導(dǎo)入受體，不僅創(chuàng)造了大量有價值的種質(zhì)資源，而且選育出的新品系已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。這些都為浸胚法導(dǎo)入外源DNA后代變異提供了依據(jù)。本試驗研究了外源DNA導(dǎo)入番茄后的變異性狀，通過配制不同濃度的DNA溶液，在不同的條件下進行暗處理，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量和同工酶有變化。但是對于這種變異是因為外源DNA導(dǎo)入引起的，還是由于基因突變引起的還不能確定，有待進一步的研究。

　　參考文獻：

　　[1] 楊前進.用浸胚法將外源DNA 導(dǎo)入水稻的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34 (24)：6452-6454.

　　[2] 許勇，周長久，王福鈞，等.外源DNA注射茄子子房后代性狀的變異[J].園藝學(xué)報，1991，18(1)：49-54.

　　[3] 黃駿麒，錢思穎，劉桂玲.外源海島棉D(zhuǎn)NA誘導(dǎo)中棉性狀的變異[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1982(11)：18-20.

　　[4] 董偉，陳玲，吳勇 .黃瓜自花授粉后外源DNA導(dǎo)入技術(shù)研究[J].園藝學(xué)報，1993，20(20)：155-160.

　　[5] 陳慶山，劉春燕，呂東，等.大豆DNA提取基本原理的探討[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004(2)：129-134.

　　[6] 葉艷萍.植物生理實驗指導(dǎo)[M].南寧：廣西大學(xué)，2003.